在微流控實(shí)驗(yàn)中，一個常見問題是：顯微鏡已經(jīng)能夠看到芯片結(jié)構(gòu)，但當(dāng)研究對象變成微納通道中的弱熒光信號時，為什么圖像仍然可能不夠清晰？

答案并不完全取決于顯微鏡的放大倍率。對于弱熒光成像，真正決定圖像能否用于科研分析的關(guān)鍵之一，是探測端能否有效記錄有限的熒光信號。

中國石油大學(xué)油氣微流控芯片試拍實(shí)驗(yàn)提供了一個典型案例。實(shí)驗(yàn)采用千眼狼(Revealer)Gloria 4.2 sCMOS科學(xué)相機(jī)與熒光顯微鏡，對微納通道中的熒光信號分布進(jìn)行觀測。

為什么微流控弱熒光信號難以清晰成像？

本次實(shí)驗(yàn)主要存在三個問題。

第一，微納通道中的熒光信號本身較弱。隨著有效發(fā)光區(qū)域減小，到達(dá)相機(jī)探測面的有效熒光信號有限。

第二，LED熒光照明存在光斑不均。同一視場不同區(qū)域的激發(fā)強(qiáng)度存在差異后，容易在圖像中形成與樣品實(shí)際分布無關(guān)的灰度變化。

第三，雜散光和背景信號會進(jìn)一步降低弱熒光區(qū)域與背景之間的對比度。

因此，此類實(shí)驗(yàn)真正需要解決的并不是“有沒有圖像”，而是弱熒光信息能否進(jìn)入可識別、可分析的數(shù)據(jù)范圍。

sCMOS相機(jī)在實(shí)驗(yàn)中具體做了什么？

實(shí)驗(yàn)采用千眼狼(Revealer)Gloria 4.2 sCMOS科學(xué)相機(jī)，配合熒光顯微鏡和LED熒光光源組成科學(xué)成像系統(tǒng)。

針對不同實(shí)驗(yàn)狀態(tài)，研究人員采用不同曝光策略。動態(tài)觀察油相流動時，曝光時間約為350 ms；靜態(tài)熒光分布觀測不受快速時間變化約束，因此將曝光時間延長至4 s。

同時采用2×2/4×4 binning及CMS低噪聲成像模式，并進(jìn)一步進(jìn)行暗場校正和平場校正，以降低固定背景和LED照明不均對弱熒光判斷的影響。

這實(shí)際上體現(xiàn)了弱熒光科學(xué)成像中的一個基本原則：曝光時間、空間采樣、噪聲控制與圖像校正需要圍繞具體研究對象進(jìn)行綜合優(yōu)化，而不能只依賴某一個相機(jī)參數(shù)。

圖1-千眼狼(Revealer)Gloria 4.2 sCMOS科學(xué)相機(jī)與熒光顯微鏡組成的微流控弱熒光成像實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，用于觀測微流控芯片微納通道中的熒光信號分布

最終能看到什么？

優(yōu)化成像條件后，實(shí)拍圖像中的微納通道能夠被明顯點(diǎn)亮，表明含熒光物質(zhì)的油相已經(jīng)進(jìn)入相應(yīng)通道。實(shí)驗(yàn)芯片最小通道結(jié)構(gòu)深度約100 nm、寬度約1 μm。

本次實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜃C明的是，微納通道中的熒光信號被有效記錄，從而可以識別油相在相應(yīng)通道內(nèi)的空間分布。

圖2-千眼狼(Revealer) Gloria 4.2 sCMOS科學(xué)相機(jī)在4 s曝光條件下拍攝的微流控芯片弱熒光圖像，可觀察含熒光物質(zhì)油相進(jìn)入微納通道后的空間分布

圖像“看得見”以后，還能做什么？

科研成像的目的通常不只是獲得一張更亮的圖片。

本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用ImageJ Threshold對熒光圖像進(jìn)行閾值處理，將含熒光物質(zhì)油相進(jìn)入的區(qū)域進(jìn)行提取和標(biāo)記，使原始灰度圖像進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為空間分布信息。

這意味著弱熒光信號一旦達(dá)到穩(wěn)定可辨識水平，就具備進(jìn)一步開展通道占據(jù)范圍、不同區(qū)域分布差異以及后續(xù)時間序列輸運(yùn)分析的基礎(chǔ)。

圖3-基于Gloria 4.2 sCMOS科學(xué)相機(jī)熒光圖像的ImageJ Threshold分析結(jié)果，用于提取微流控芯片微納通道中含熒光物質(zhì)油相的空間分布區(qū)域。

微流控實(shí)驗(yàn)為什么會用到sCMOS科學(xué)相機(jī)？

在微流控弱熒光實(shí)驗(yàn)中，sCMOS科學(xué)相機(jī)真正解決的是弱信號的數(shù)據(jù)可用性問題：將低光子通量條件下原本難以清晰識別的熒光信息轉(zhuǎn)化為可觀察、可提取和可進(jìn)一步分析的數(shù)字圖像。

對于熒光標(biāo)記微流控、微納通道流體分布以及微尺度輸運(yùn)研究，這種從“看不清”到“能夠形成科學(xué)數(shù)據(jù)”的變化，才是科學(xué)相機(jī)最直接的實(shí)驗(yàn)價值。